Identificar bacterias es un proceso complejo. Esto se debe en parte a que hay tantos tipos: ¡las estimaciones del número de especies varían de alrededor de 10,000 a más de mil millones![1] Ser capaz de identificar bacterias correctamente es especialmente importante en entornos clínicos, ya que el tratamiento adecuado puede depender del tipo de bacteria que causa una infección. En la mayoría de los casos, identificar las bacterias es un proceso de eliminación. Para identificar bacterias, use técnicas de tinción, tome nota de la apariencia de las bacterias y observe cómo reaccionan las bacterias ante diferentes condiciones. Para determinar rápidamente la especie exacta de bacteria, envíe una muestra para la prueba de ADN.

Método uno de cuatro:
Identificación de bacterias con tinción de Gram

  1. 1 Use tinción de Gram para ver si las bacterias son Gram positivas o Gram negativas. La tinción de Gram es un procedimiento que le permite dividir las bacterias en dos tipos comunes: Gram positivo y Gram negativo. Las bacterias Gram positivas tienen una pared celular extra gruesa (hecha de un polímero llamado peptidoglicano) que retiene mejor una mancha de tinte que las paredes celulares más delgadas de las bacterias Gram negativas.[2]
    • Los géneros comunes de bacterias Gram positivas incluyen Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus y Listeria.[3]
    • Los géneros de bacterias Gram negativas comunes incluyen Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Enterobacteriaceae, Haemophilus, Vibrio, Campylobacter y Fusobacterium.[4]
  2. 2 Use precauciones de seguridad. Las bacterias y productos químicos que va a manipular durante un procedimiento de tinción de Gram son potencialmente peligrosos. Use gafas de protección, guantes de nitrilo desechables y una bata de laboratorio mientras realiza la mancha. Cuando termine, coloque sus guantes desechables y cualquier otro material de desecho contaminado en una bolsa de riesgo biológico. Siga los procedimientos de su laboratorio para deshacerse de la bolsa de riesgo biológico.[5]
  3. 3 Haga una diapositiva de su muestra bacteriana. Para comenzar el proceso, coloque una pequeña gota o pieza de su muestra bacteriana en un portaobjetos estéril. Pase el portaobjetos por la llama de un mechero Bunsen 3 veces para calentar la muestra.[6] Esto evitará que la muestra se elimine cuando agregue reactivos o enjuague la diapositiva.
  4. 4 Agregue 5 gotas de violeta cristal a la diapositiva. Coloque las gotas de colorante violeta cristal sobre el cultivo fijado al calor. Deje que la muestra empape el colorante violeta cristal durante 1 minuto.[7]
    • Para evitar manchar su mano, puede mantener la diapositiva en su lugar con un alfiler de ropa.[8]
  5. 5 Enjuague suavemente la diapositiva para eliminar la mancha. Use una corriente de agua muy suave de un fregadero o botella de chorro. No enjuagar por más de 5 segundos.[9] Este proceso eliminará cualquier tinte que no esté vinculado a la muestra.
  6. 6 Agregue 5 gotas de yodo de Gram a la diapositiva. El yodo de Gram es una solución de yodo, yoduro de potasio y bicarbonato de sodio.[10] Esta solución hará que el colorante violeta cristal se fusione con las paredes celulares de la bacteria. Agregue aproximadamente 5 gotas, y déjelo reposar durante 1 minuto.[11]
  7. 7 Enjuague la muestra con alcohol o acetona. El alcohol y la acetona son agentes decolorantes. Si sus bacterias son una cepa Gram negativa, estos agentes eliminarán la mancha de las paredes celulares bacterianas. Permita que unas gotas del agente decolorante goteen sobre la muestra y déjela reposar durante no más de 3 segundos. Enjuague suavemente con agua durante no más de 5 segundos para eliminar el alcohol o la acetona.[12]
    • Si deja que el agente decolorante permanezca en la muestra demasiado tiempo, puede eliminar la mancha de las bacterias Gram positivas, lo que ocasiona un resultado Gram negativo falso.
  8. 8 Contrarresta la solución con safranina. Safranin es un colorante rojo, que actuará como una contratinción de la violeta cristal y teñirá cualquier bacteria que no tenga la mancha violeta. Agregue aproximadamente 5 gotas de solución de safranina a la muestra, y déjela reposar durante 1 minuto. Enjuague muy suavemente con agua durante 5 segundos.[13]
  9. 9 Vea su muestra bajo el microscopio con un aumento de 1000X. Si las bacterias son una cepa Gram positiva, aparecerán violetas o moradas bajo el microscopio. Las bacterias Gram negativas aparecerán rojas a partir de la contratinción de safranina.[14]

Método dos de cuatro:
Usando la técnica de tinción de Ziehl-Neelsen

  1. 1 Use la tinción de Ziehl-Neelsen para detectar bacterias ácido-resistentes. Las bacterias ácidas contienen una mayor cantidad de lípidos que otros tipos de bacterias, lo que las hace resistentes a los agentes colorantes utilizados en la tinción de Gram. Las bacterias ácido-resistentes pertenecen al género Mycobacterium, que incluye la bacteria que causa la tuberculosis (M. tuberculosis). Las bacterias ácidas-rápidas se pueden teñir con un tinte rojo de carbol-fucsina, que se resiste a enjuagarse con una solución de ácido alcohol o ácido sulfúrico.[15]
  2. 2 Tome las precauciones de seguridad adecuadas. Los productos químicos y biológicos utilizados durante un procedimiento de tinción de Ziehl-Neelsen pueden ser peligrosos. También utilizará fuentes de calor, como un mechero Bunsen, una lámpara de alcohol o un calentador eléctrico deslizante. Tome las siguientes precauciones al realizar este procedimiento:[16]
    • Use gafas de protección, guantes de nitrilo y una bata de laboratorio.[17]
    • Tenga cuidado de no inhalar los vapores de las soluciones de decoloración o manchas, ni los contamine con la piel o los ojos. Mantenga cualquier recipiente abierto debajo de una campana extractora.[18]
    • Tenga mucho cuidado al calentar su portaobjetos, ya que muchos de los productos químicos que utilizará son inflamables. También puede haber rastros de químicos inflamables en los bastidores de deslizamiento y otros equipos.[19]
  3. 3 Prepare una diapositiva. Extiende un frotis de tu muestra uniformemente sobre el centro de un portaobjetos estéril, usando movimientos circulares. Su extensión debe ser de aproximadamente 10 mm (0,4 pulgadas) por 20 mm (0,8 pulgadas).[20]
  4. 4 Seca tu diapositiva. Coloque la diapositiva en un estante de secado con la cara hacia arriba. Deje que se seque al aire durante 30 minutos.[21] No intente secar el portaobjetos.
  5. 5 Calor arregla tu frotis. Puede calentar la muestra pasando el portaobjetos sobre la llama de un mechero Bunsen 2-3 veces, con la cara untada hacia arriba.Alternativamente, coloque la diapositiva en un calentador eléctrico de diapositivas a 65 ° -75 ° C (149 ° -167 ° F) durante al menos 2 horas.[22] Tenga cuidado de no quemar ni hervir la muestra.
  6. 6 Agregue la tinción de carbol-fuchsin a su portaobjetos. Ponga varias gotas de solución de carbol-fucsina en la diapositiva. Agregue suficiente para cubrir completamente el frotis.[23]
  7. 7 Caliente el portaobjetos teñido para fijar la mancha al frotis. Calienta suavemente la diapositiva sobre un mechero Bunsen o una lámpara de alcohol, con el lado sucio hacia arriba o colócalo en un calentador eléctrico deslizante. Calienta la diapositiva hasta que llegue a 60 ° C (140 ° F). Deberías ver que el vapor comienza a subir. Deje que la mancha calentada se asiente en la diapositiva durante 5 minutos.[24]
    • Si está usando un calentador deslizante eléctrico, ajústelo a 60 ° C (140 ° F). Si usa un mechero Bunsen o una lámpara de alcohol, deberá observar cuidadosamente la aparición de vapor o vapor.
    • Para mantener el portaobjetos a la temperatura deseada durante 5 minutos, aplique calor intermitentemente.[25]
    • Tenga cuidado de no hervir, quemar ni secar completamente el frotis manchado.
  8. 8 Enjuague la diapositiva con agua fría. Deje que el portaobjetos se enfríe durante aproximadamente 5 minutos, luego enjuague muy suavemente por unos segundos con agua limpia de un grifo o botella para eliminar cualquier mancha que no esté unida a la muestra.[26]
  9. 9 Cubra el frotis con alcohol ácido o ácido sulfúrico. Agregue suficiente volumen del 3% sobre el volumen (v / v) de alcohol ácido o 20% de ácido sulfúrico para cubrir completamente el frotis. Deje el ácido en la diapositiva hasta que la mancha se haya desteñido a un rosa muy pálido.[27] Esto generalmente toma al menos 10 minutos.[28]
  10. 10 Enjuague la diapositiva con agua limpia. Enjuague suavemente con agua de un grifo o apriete la botella, asegurándose de eliminar todo el ácido y los restos de colorante restantes.[29]
  11. 11 Agregue contratinción a la diapositiva. Una vez que se haya enjuagado el portaobjetos, cubra su mancha con verde de malaquita o con la solución de azul de metileno de Loeffler. Estas soluciones crean un "fondo" verde o azul que ayuda a las bacterias teñidas de rojo y también mancha cualquier otro material biológico en el portaobjetos (como las células humanas y las bacterias que no son acidorresistentes). Deja que la mancha repose durante 1-2 minutos.[30]
  12. 12 Enjuague y seque la diapositiva. Lave el portaobjetos suavemente con agua limpia para eliminar cualquier exceso de contratinción. Cuando haya terminado, limpie la parte posterior de la diapositiva con un paño limpio y coloque la diapositiva en una rejilla para que se seque al aire.[31]
  13. 13 Examine la diapositiva bajo un microscopio a 1000 aumentos. Las bacterias ácidas deben aparecer de color rojo o rosa fuerte. Las bacterias no ácidas, las células no bacterianas y el fondo aparecerán de color azul o verde.[32]

Método tres de cuatro:
Observando la Apariencia y el Comportamiento Bacterianos

  1. 1 Observe la forma de la bacteria. Una vez que haya usado las tinciones para determinar si sus bacterias son Gram positivas, Gram negativas o ácidas, es hora de reducir el tipo de bacteria. El primer paso es observar la (s) forma (s) de la bacteria en la diapositiva. Las 3 formas más comunes son coco (esférico), bacilo (en forma de barra) y espiral.[33]
    • Hay numerosas variaciones en todas estas formas. Por ejemplo, las bacterias coccus pueden aparecer en diversas formaciones, como pares fusionados (diplococcus), cadenas, grupos o grupos de 4 (tétradas).
  2. 2 Determine si las bacterias son aeróbicas o anaeróbicas. Toma 2 muestras de la bacteria y crea 2 cultivos separados. 1 cultivo debe ser anaeróbico (crecido sin oxígeno) y el otro debe ser aeróbico (crecido con oxígeno). Almacene su cultivo anaeróbico en un ambiente libre de oxígeno a 35 ° C (95 ° F) durante al menos 48 horas antes de intentar observar el crecimiento bacteriano.[34]
    • Si sus bacterias crecen en un ambiente libre de oxígeno, pero no cuando están expuestas al oxígeno, son anaeróbicas.
    • Las bacterias que crecen cuando se exponen al oxígeno, pero no cuando se mantienen en un ambiente libre de oxígeno, son aeróbicas.
    • Las bacterias que pueden crecer en ambos ambientes se llaman anaerobios facultativos.
  3. 3 Haga una prueba de motilidad para descubrir si sus bacterias son móviles. Las bacterias móviles pueden moverse por sí mismas al usar 1 o más flagelos para impulsarse. La motilidad o la falta de motilidad pueden ser un factor importante para identificar una cepa de bacterias.[35] Existen varios tipos de pruebas de motilidad, pero la prueba de medio semisólido es la más segura y fácil de leer.
  4. 4 Crea una cultura para tu prueba de motilidad. Prepare un cultivo de bacterias en un caldo nutriente. Prepare el caldo de acuerdo con las instrucciones para su caldo de cultivo preferido.[36]
  5. 5 Inocular un tubo de agar de motilidad semisólida con su cultivo. Cubra una aguja de inoculación estéril con algo del caldo de cultivo. Cuidadosamente apuñalar la aguja directamente en un tubo de agar semisólido formulado para la prueba de motilidad (como agar TTC). La aguja debe dar 2/3 del recorrido en el agar.[37]
    • Cuando termine, retire cuidadosamente la aguja, teniendo cuidado de no romper la "línea de cuchilla" original.
    • Incubar el tubo a 30 ° C (86 ° F) durante 48 horas.[38]
  6. 6 Lea los resultados de la prueba de motilidad. El agar de motilidad se vuelve rojo cuando entra en contacto con bacterias. Si su bacteria es móvil, se difundirá un color rojo o rosado por todo el agar. Si no son móviles, solo verá el color rojo a lo largo de la línea original.[39]

Método cuatro de cuatro:
Poniendolo todo junto

  1. 1 Pon tus observaciones juntas. Para reducir el género de las bacterias, deberá combinar la información de sus manchas, cultivos y observaciones de la forma bacteriana. Si está probando una cultura de un paciente, la información sobre sus síntomas también puede ser útil para reducir el campo.[40]
    • Por ejemplo, si sus pruebas revelan que sus bacterias son bacilos Gram negativos, anaeróbicos, no móviles, y que están asociados con dolor abdominal, náuseas y vómitos en el paciente, es probable que sean Bacteroides fragilis.[41]
  2. 2 Consulte una base de datos de bacterias. Como hay tantas especies de bacterias, es imposible recordarlas o reconocerlas todas por su cuenta. Probablemente necesite consultar un libro de texto de microbiología clínica o una base de datos en línea y buscar bacterias con todas las características de su muestra.
    • Los buenos recursos en línea para identificar bacterias incluyen el Centro de Integración de Recursos Pathosystems (patricbrc.org) y la base de datos de Bacterias Patógenas en GlobalRPh (globalrph.com/bacterial-strains.htm).
  3. 3 Use pruebas genéticas para determinar la especie exacta de bacteria. En algunos casos, puede ser necesario identificar la especie exacta de bacteria. La forma más rápida y efectiva de hacerlo es con las pruebas de ADN. Las pruebas de ADN también son útiles para identificar bacterias que resisten las formas tradicionales de cultivo o tinción.[42] Las pruebas modernas de ADN microbiano se pueden realizar muy rápidamente, a veces en tan solo 2 horas.[43]
    • Si no tiene acceso a un laboratorio que realice la secuenciación del genoma microbiano, envíe una muestra a un centro especializado, como MIDI Labs o CD Genomics.